Bestimmung von sauren und neutralen Arzneimittelwirkstoffen in Wasserproben
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Manuskript
Email-Adresse: norbert.breidenich@stua-ac.nrw.de
Vortragsskript Umweltanalytiktage NRW vom 19. bis 21.06.2000
Berichte über Arzneimittelfunde in Abwässern kommunaler Kläranlagen, Oberflächenge-wässern und Grundwässern waren 1998 Anlass, im Labor des Staatlichen Umweltamtes Aachen Methoden für die Bestimmung von Arzneimitteln und deren Rückständen zu entwickeln [Lit.-Liste]. Die ausgearbeiteten Analysenmethoden wurden im Zuge mehrerer Messprogramme an Realproben erprobt und entsprechend der gesammelten Erfahrungen weiterentwickelt.
Folgende Ergebnisse liegen vor:
- Es wurden zwei Analysenmethoden zur Bestimmung neutraler und saurer Pharmaka aus Grund-, Oberflächen- und Abwasserproben entwickelt und eingearbeitet.
- Proben von Kläranlagenabläufen, Gewässern und Rohwässern wurden auf Pharmaka untersucht.
- In vielen Proben wurden Arzneimittel bzw. Metabolite qualitativ und quantitativ nachge- -wiesen. Aktuelle Ergebnisse sind als Anlagen beigefügt.
- Es wird versucht die Bestimmungsgrenzen für die neutralen Arzneimittel weiter abzusenken.
- Es wird weiterer Untersuchungsbedarf gesehen.
- Das lfd. Kläranlagenmessprogramm wird fortgeführt um statistische Auswertungen zu ermöglichen.
- Die Analysenmethoden werden durch Teilnahme am BLAC-Ringversuch erprobt.
Die Literaturrecherche erfolgte gezielt im Hinblick auf die analytische Bestimmung von Arzneimitteln/Arzneimittelrückständen in Oberflächen-, Trink-, Grund- und Abwasser mittels GC und GC-MS.
Ergebnis der Literaturrecherche war, dass die Extraktion der Arzneimittel mittels Festphasenanreicherung die höchsten Wiederfindungsraten bei Wasserproben ergab. Basierend auf der Literaturstelle von F.Sacher, E.Lochow, D.Bethmann und H.J.Brauch "Vorkommen von Arzneimittelwirkstoffen in Oberflächengewässern", Zeitschrift Vom Wasser, 90, 233-243 (1998) [Lit.1.1] wurde je eine Analysenmethode für folgende Einzelwirkstoffe erarbeitet:
| Wirkstoff | Verabreichung |
| Phenacetin | Analgetika |
| Phenazon | Analgetika |
| Carbamazepin | Antiepiletika |
| Pentoxifyllin | Vasodilator |
| Fenofibrate | Lipidsenker |
| saure Pharmaka | |
| Clofibrinsäure | Matabolit von Fenofibrat |
| Ibuprofen | Antirheumatika |
| Gemfibrozil | Lipidsenker |
| Fenoprofen | Antirheumatika |
| Naproxen | Antirheumatika |
| Ketoprofen | Antirheumatika |
| Indometacin | Antirheumatika |
| Tolfenaminsäure | Antirheumatika |
| Diclofenac | Antirheumatika |
| Meclofenaminsäure | Antirheumatika |
3. Analysenmethode
3.1 Probenahme und Probenvorbereitung
Für die Probenahme werden mit Aceton und dest. Wasser gespülte Glasgerätschaften verwendet. Für eine Doppelbestimmung werden jeweils 4 x 1 l Wasserprobe in Braunglas-Steilbrustflaschen blasenfrei abgefüllt. Die Proben werden gekühlt ins Labor transportiert.
3.2 Wiederfindungsraten
Zur Bestimmung der Wiederfindungsraten wurde Leitungswasser mit je 0,5 und 1,0 µg/l der einzelnen Wirkstoffe aufgestockt und nach der im folgenden beschriebenen Methode analysiert.
Zu Beginn der Untersuchungen wurde versucht saure und neutrale Arzneimitte gemeinsam bei pH 3 anzureichern. Hierbei wurde festgestellt, dass:
- die sauren Arzneimittel zufriedenstellende Wiederfindungsraten aufwiesen.
- die neutralen Wirkstoffe, insbesondere Phenazon und Phenazetin deutlich geringere und weniger reproduzierbare Wiederfindungsraten ergaben.
| Wirkstoff |
Wiederfindung in % pH 3
|
Wiederfindung in % pH 7
|
| Phenacetin |
Okt 40
|
60 - 65
|
| Phenazon |
Okt 35
|
41 - 47
|
| Carbamazepin |
70 - 92
|
95 - 100
|
| Fenofibrat |
75 - 88
|
88 - 95
|
| Pentoxyfillin |
67 - 85
|
85 - 92
|
3.2 Festphasenanreicherung
Getrübte Proben werden vor der Anreicherung über Membranfilter (Cellulose Acetat, 0,45 µm) filtriert.
Die Anreicherung der o.g. Pharmawirkstoffe erfolgt auf RP-C18-Fertigsäulen der Fa. Baker. Das Füllvolumen beträgt 1000 mg. Die Säulen werden mit 4 ml iso-Propanol und anschließend mit 4 ml dest. Wasser konditioniert. Ein Trockenfallen der Säulen muss wegen der Bildung von Fließkanälen vermieden werden! Anschließend wird 1 l Wasserprobe mit einem Fluss von 5 ml/min über die Säulen gesaugt. Hierfür wird ein leichtes Vakuum an die Anreicherungseinheit angelegt.
Nach erfolgter Anreicherung werden die Säulen bei -18 oC tiefgefroren und danach mindestens 2h gefriergetrocknet. Die Trocknung kann auch mit Stickstoff erfolgen. Die Fertigsäulen werden bis zur Elution im Exsikator aufbewahrt.
Die angereicherten Arzneimittel werden durch portionsweise Zugabe von 5 ml iso-Propanol eluiert. Der Isopropanolextrakt wird mittels Rotationsverdampfer auf 0,1 (neutrale Arzneimittel) , bzw. 1 ml (saure Arzneimittel) eingeengt. In Ermangelung von auf 0,1 ml kalibrierten Spitzgläsern wird der Extrakt bis fast zur Trockene eingeengt und mittels 100 µl-Spritze aufgenommen (70 - 80 µl). Die teilgefüllte Spritze wird anschließend mit Isopropanol bis zur 100 µl-Marke aufgezogen . Die 100 µl werden in mit Mikroeinsätzen versehenen Autosamplerfläschchen überführt.
3.3 Derivatisierung mit Trimethylsulfoniumhydroxid (TMSH)
TMSH wird in der Literatur als gutes Methylierungsmittel zur gaschromatographischen Erfassung von Carbonsäuren in kleinsten Mengen beschrieben.
Eine Entfernung des Reagenzienüberschusses wird lt. Lit. nicht für erforderlich gehalten, da im Injektor des Gaschromatographen ab 250 oC nur eine Pyrolyse des TMSH zu leicht flüchtigem Methanol und Disulfid erfolge [Lit.1.9].
Zur GC-MS-Bestimmung der sauren Arzneimittelwirkstoffe wird jeweils ein Extraktaliquot mit 30 µl einer 0,2 M methanolischen TMSH-Lösung versetzt. Die Autosamplerfläschchen werden nach Zugabe des Derivatisierungsreagenzes leicht geschüttelt. Die Einspritzung in das GC-MS-Gerät sollte bis spätestens 24 h nach TMSH-Zugabe erfolgen. Ein Vorteil der TMSH-Derivatisierung ist, dass die Derivatisierungsreaktion im heissen Injektor (275 oC) erfolgt.
Im Zuge der durchgeführten Untersuchungen wurde jedoch festgestellt:
- dass die Nachweisempfindlichkeit der neutralen Arzneimittel nach größeren Analysenserien der sauren Arzneimittel gravierend schlechter wurde.
- dass gleichzeitig bei der Bestimmung der neutralen Verbindungen eine deutliche Verschlechterung der Trennleistung beobachtet wurde, die sich in Peakverbreiterung und -tailing äußerte.
Der Säulenwechsel kann neuerdings ohne zeitaufwendiges Herunterfahren der Ionenfalle durchgeführt werden und dauert ca. 30 min.. Hierbei wird nach Lösen der Analysensäule von der Transferline ein Blindstopfen eingeschraubt, sodass das Vakuum in der Falle erhalten bleibt. Der Säulenwechsel wird auch für den routinemäßig erforderlichen Wechsel von Injektorinsert und Septum genutzt.
3. Geräte-Bedingungen
Gaschromatograph: Varian 3400 CX
Injektor: Varian 1078 Split/Splitlos-Injektor
Injektor-Insert: Glasinsert offen, desaktiviert, 3,4 mm ID
Injektor-Temperatur: 275 oC
Kapillartrennsäulen :
Neutrale Arzneimittel: DB 5 MS, 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 µm FD (Fa. J&W)
Saure Arzneimittel: Optima d3, 30 m, 0,25 mm ID, 0,25 µm FD (Fa. Macherey & Nagel)
Temperaturprogramm: 70 oC, 1 min
70 - 280 oC, 15 oC/min
280 - 300 oC, 5 oC/min
300 oC, 10 min
Autosampler: Varian 8200 Cx
Injektionsvolumen: 2 µl
Injektionsrate: 5 µl/sek.
4. Spektrenbibliothek und Ergebnisse MS
Für die massenspektrometrische Identifizierung der Arzneimittelwirkstoffe und Metabolite wurden für die neutralen und sauren Verbindungen je eine Massenspektrenbibliothek angelegt. Eine Steigerung der Nachweisempfindlichkeit konnte mittels Einsatz der MS-MS erreicht werden. Hier wurde im sog. SIM-Modus gearbeitet. Je nach Substanz können Bestimmungsgrenzen von 0,01 bis 0,1 µg/l erreicht werden.
| Wirkstoff |
Ret.Zeit (min.)
|
Ion für SIM
|
| Phenacetin |
23.71
|
179
|
| Phenazon |
28. Aug
|
188
|
| Carbamazepin |
29.85
|
193
|
| Fenofibrat |
40.06
|
221
|
| Pentoxyfillin |
40.53
|
121
|
| Methylpentadecanoat (Int.St.) |
26. Nov
|
143
|
Tabelle 3 - GC-MS-Bedingungen saure Arzneimittel
| Wirkstoff |
Ret.Zeit (min.)
|
Ion für SIM
|
| Clofibrinsäure |
19.48
|
128
|
| Ibuprofen |
20.36
|
161
|
| Gemfibrozil |
27.63
|
143
|
| Fenoprofen |
29.79
|
197
|
| Naproxen |
32.41
|
244
|
| Ketoprofen |
34.84
|
193
|
| Indomecatin |
35.15
|
188
|
| Tolfenaminsäure |
35.43
|
208
|
| Diclofenac |
36.21
|
214
|
| Meclofenaminsäure |
37.85
|
243
|
| 2,3-Dichlorphenoxyessigsäure (Int.St.) |
24.78
|
199
|
Im Rahmen verschiedener Messprogramme wurden Kläranlagenabläufe, Rohwässer und Fließgewässerproben untersucht. Die untersuchten kommunalen Kläranlagen sind den Größenklassen II bis V zuzuordnen. Es handelt sich überwiegend um mechanisch-biologische Kläranlagen mit Filtrationsstufe. Eine Kläranlage arbeitet mittels Membrantechnologie. Um den Einfluss von arzneimittelrelevanten Indirekteinleitern zu überprüfen, wurden Kläranlagen mit und ohne angeschlossene Krankenhäuser und Kurkliniken untersucht.
Die untersuchten Rohwässer stammen von verschiedenen Wasserwerken, die Talsperren- und oberflächennah anstehendes Grundwasser aufbereiten.
6. Untersuchungsergebnisse Kläranlagen
Die bisher fünfmalige Untersuchung von 11 Kläranlagen zeigte, dass in den Abläufen von fast allen Kläranlagen 6-7 Einzelwirkstoffe oberhalb der jeweiligen Bestimmungsgrenzen nachgewiesen wurden. Die höchsten Messwerte wurden für das Schmerzmittel und Antiepileptikum Carbamazepin (3,1 µg/l) und für das Rheumamittel Diclofenac (1,1 µg/l) gefunden. In drei Kläranlagenabläufen wurden im Vergleich zu den übrigen Probenahmestellen deutlich erhöhte Naproxengehalte (0,16 - 2,3 µg/l) festgestellt. Der Einfluss von arzneimittelrelevanten Indirekteinleitern ist bei Kläranlagen mit niedrigen Einwohnergleichwerten erkennbar , während bei größeren Kläranlagen dsbzgl. derzeit keine eindeutige Aussage möglich ist.
Das lfd. Kläranlagenmessprogramm wird weiter fortgeführt um statistische Auswertungen zu ermöglichen.
In den untersuchten Rohwasserproben wurden keine Arzneimittel in Konzentrationen oberhalb der jeweiligen Bestimmungsgrenzen nachgewiesen.
Bei zukünftigen Untersuchungen wird der Steigerung der Nachweisempfindlichkeit bei den neutralen Arzneimittelwirkstoffen Phenacetin, Phenazon und Pentoxyfillin eine hohe Bedeutung beigemessen.
| 1.1 | Vorkommen von Arzneimittelwirkstoffen in Oberflächengewässern, F.Sacher, E.Lochow, D.Bethmann, H.J. Brauch - Vom Wasser, 90, 233-243, (1998) |
| 1.2 | Nachweis von Arzneimittelrückständen in Kläranlagen und Fließgewässern, M.Stumpf, T.Ternes, K.Haberer, P.Seel, W.Baumann - Vom Wasser, 86, 291-303, (1996) |
| 1.3 | Simultane Bestimmung von Antiseptika und sauren Pharmaka in Abwasser und Fließge- wässern, T.Ternes, M.Stumpf, B.Schuppert, K.Haberer - Vom Wasser, 90, 295-309, 1998) |
| 1.4 | Nachweis von natürlichen und synthetischen Östrogenen in Kläranlagen und Fließge- wässern, M.Stumpf, T.Ternes, K.Haberer, W.Baumann - Vom Wasser, 87, 251-261, (1996) |
| 1.5 | Occurence of drugs in german sewage treatment plants and rivers, T.Ternes, Wat.Res. Vol.32, No.11, pp.3245-3260, 1998 |
| 1.6 | Bestimmung von Steroidhormonen in Trink- und Oberflächenwässern, K.Schlett, B.Pfeifer, Vom Wasser, 87, 327-333 (1996) |
| 1.7 | Bestimmung von Arzneimittelrückständen im Grund- und Oberflächenwasser, T.Heberer, Vortragsmanuscript INCOM 1997 |
| 1.8 | GC/MS/MS zur strukturspezifischen Detektion, H.J.Hübschmann , Sonderdruck aus Laborpraxis mit Massenspektren der Antidepressiva Cyclobenzaprin, Amitryptilin und Doxepin |
| 1.9 | Derivatisierungstechniken in der Rückstandsanalytik, M.Syhre, G.Hanschmann, R.Heber,GIT Fachz.Lab. 11/96, 1121-1128 |
| 1.10 | Neue autoselektive GC-Phase im mittelpolaren Bereich für die Umweltanalytik, W.Röder, D.Lennartz, GIT Fachz.Lab. 3/99, 226-229 |
| 2.1 | Arzneimittel in Gewässern - Risiko für Mensch, Tier und Umwelt ?, Tagungsband Hessische Landesanstalt für Umwelt, 4.6.1998 |
| 2.2 | Endokrin wirksame Stoffe in Oberflächengewässern, Dr.K.Vogt, Kompaktkurs 16.- 18.2.1998 Ruhr Uni Bochum |
| 2.3 | Endokrin wirkende Substanzen - Auswirkungen auf Gewässer und Boden, S.Thaler, Korrespondenz Abwasser 1998 (45) Nr.3 |
| 2.4 | Angriff auf die Männlichkeit, Geo-Heft Nr.12, 1994, S.120-132 |
| 2.5 | Erster BUA-Sachstandsbericht zu hormonähnlich wirkenden Stoffen in der Umwelt, 1997 |
| 2.6 | Hormonähnlich wirkende Stoffe in der Umwelt - Einführung und Sachstand, H.Greim, GDCh-Presseseminar am 21.11.1997 |
| 2.7 | Auswirkungen von Arzneimitteleinträgen auf die Umwelt und die Trinkwasserversorgung Umwelt Nr.1/1999 |
| 2.8 | ATV-Schriftenreihe 15 - Endokrine Stoffe |
| 2.9 | BLAC - Auswirkungen der Anwendung von Clofibrinsäure und anderer Arzneimittel auf die Umwelt und Trinkwasserversorgung |
| 2.10 | Endokrin wirkende Stoffe in kommunalen Klärschlämmen - Beispiel zinnorganischer Verbindungen, Wasser & Boden, 50/9, 30-32 (1998) |
| 2.11 | Noch mehr Gift im Klärschlamm?, Korrespondenz Abwasser 1998 (45) Nr.5 |
| 2.12 | "Endokrin-aktive Stoffe im Bodensee", 2.Statuskolloquium im Neuen Schloß Meersburg gwf Wasser Abwasser 139 (1998) Nr.8, S. 515-516 |
| 2.13 | Ausgewählte Aspekte zu Krankenhausabwasser, Korrespondenz Abwasser 1998 (45) Nr.12, S. 2225-2230 |
| 2.14 | Umweltprobleme durch Arzneimittel - Literaturstudie, UBA-Texte 60/96 |
| 2.15 | Verschiedene Texte zu einzelnen Arzneimittelwirkstoffen aus Römpp-Chemielexikon |
| 2.16 | Ergebnis DABAWAS-Abfrage zu Nonylphenol vom 14.04.1994 |
| 2.17 | Kurzes Lehrbuch der Biochemie für Mediziner und Naturwissenschaftler, Georg Thieme Verlag, 20. Kapitel - Hormone, S. 316-344 |
| 2.18 | AOX im Krankenhausabwasser - Eine Studie zu Herkunft, Menge und Substitution, gwf Wasser Abwasser, 140 (1999) Nr.1, S. 20-26 |
| 2.19 | Wirksamkeit der Uferfiltration für die Entfernung von polaren organischen Spurenstoffen gwf Wasser Abwasser, 141 (2000) Nr.4, S. 226-234 |